ヒントとコツ | 共免疫沈降（Co-IP）のトラブルシューティング
「共免疫沈降（Co-IP：Co-immunoprecipitation）」または「プルダウンアッセイ（Pull-down assay）」とは、免疫沈降用ビーズに結合したVHH抗体（別名：Nanobody®）や従来型抗体を使用し、細胞抽出物から目的タンパク質とその相互作用因子を分離する手法です。免疫沈降用ビーズと特異的に結合するタンパク質（直接的に免疫沈降される既知タンパク質）は「ベイト（bait：餌、相互作用物質を釣るための「餌」となるタンパク質）」と呼ばれます。一方、免疫沈降されるタンパク質との相互作用物質は「プレイ（prey：餌食、餌で釣られるタンパク質）」と呼ばれます。
GFP-Trap®を使用した共免疫沈降（Co-IP）
本稿では、クロモテック（2020年よりプロテインテックの一部）の「GFP-Trap®（免疫沈降用ビーズ結合抗GFP VHH抗体）」を使用した共免疫沈降（Co-IP：Co-immunoprecipitation）を例に挙げ、共免疫沈降のトラブルシューティングについて解説します。以下のイラストで示されるように、GFP-Trap®は、免疫沈降用ビーズ担体と結合した抗GFP VHH抗体（別名：Nanobody®）製品です。GFP-Trap®は、GFP融合ベイトタンパク質（GFP：淡緑色、ベイトタンパク質：暗緑色）を特異的に捕捉し、ベイトタンパク質と相互作用するプレイタンパク質（赤）を同時に分離します。この共免疫沈降の反応後、ウェスタンブロット（WB：Western blot）法を利用してさらなる解析を実施します。その際、GFPモノクローナル抗体（カタログ番号：3h9）のようなGFPタンパク質を検出する抗体、およびプレイタンパク質を検出する抗体を使用します。
共免疫沈降実験は、ポジティブコントロールとネガティブコントロール実験と共に実施されます
プロテインテックのブログ記事「共免疫沈降（Co-IP）の実施方法」では、共免疫沈降の実験方法を解説しています。良好な結果を得るために必要なコントロール実験に関しては、同ブログ記事で詳述していますのであわせてご覧ください。
- ポジティブコントロール実験：プレイタンパク質が存在しない実験条件で、GFPタンパク質またはGFP-ベイトタンパク質の免疫沈降をそれぞれ実施します。GFPタンパク質またはGFP-ベイトタンパク質を結合画分（免疫沈降実施後にビーズに結合していた画分）にそれぞれ検出することができた場合、使用したプロトコールが免疫沈降に適した実験条件であることを確認できます。
- ネガティブコントロール実験：GFP-ベイトタンパク質およびGFPタンパク質が存在しない実験条件で、プレイタンパク質の免疫沈降を実施します。GFP-ベイトタンパク質およびGFPタンパク質が存在しない実験条件の場合、その相互作用物質であるプレイタンパク質は結合画分には検出されません。
- 共免疫沈降実験（本実験）：GFP-ベイトタンパク質が存在する実験条件で免疫沈降を実施し、プレイタンパク質を分離します。GFP-ベイトタンパク質とプレイタンパク質が共に結合画分に検出された場合、両者は互いに相互作用する物質であることを確認できます。
コントロール実験を含め共免疫沈降の全実験を実施後、GFPタンパク質を検出する抗体とプレイタンパク質を検出する抗体でWB解析を行うと、理想的には以下のイラストで示すような結果が得られます。
トラブルシューティング
本項では、共免疫沈降実験で頻繁に生じる3種類のトラブルについて、GFP-Trap®を使用してGFP-ベイトタンパク質を捕捉し、同時にプレイタンパク質を共免疫沈降する場合を例に挙げて解説します。免疫沈降実験で必ず実施するコントロール実験を中心に、WB解析でどのように問題点があらわれるのか、それらの原因の特定方法と最終的な解決方法を紹介します。本項で扱う共免疫沈降実験のトラブルシューティング方法は、GFP-Trap®の使用を想定していますが、同様の原則はGFPタンパク質以外のタンパク質タグやエピトープタグに対する抗体を使用した免疫沈降実験にも適用できます。
I：GFP-ベイトタンパク質がプルダウンされない
第1の事例は、インプット画分（Input）にはGFP-ベイトタンパク質が存在するものの、免疫沈降を実施してもプルダウンされず、免疫沈降画分（IP:GFP）にGFP-ベイトタンパク質が検出されない事例です。その場合、必然的にプレイタンパク質も免疫沈降画分で確認することはできません。イラストで示したWB解析の例においては、GFPタンパク質単体を用いたポジティブコントロールサンプルではGFPタンパク質がプルダウンされています。そのため、免疫沈降の実験条件は適切であると考えられます。つまり、GFP-ベイトタンパク質のプルダウン時において何らかの問題が生じていると結論付けることができます。
考えられる理由として、GFP-ベイトタンパク質が細胞溶解操作やそれに伴うアンフォールディングを原因として不溶化してしまい、ごく微量にしか免疫沈降されない、またはまったく免疫沈降されていない可能性があります。
この場合、まずはGFP-ベイトタンパク質の免疫沈降実験の条件を最適化することを推奨します。GFP-ベイトタンパク質を異なる条件で発現させたり、細胞溶解や免疫沈降時のバッファー組成、操作条件を変えて予備実験を行います。GFP-ベイトタンパク質が適切に免疫沈降できる条件を決定後、GFP-ベイトタンパク質とプレイタンパク質の存在下で共免疫沈降を再度実施してください。
II：プレイタンパク質がプルダウンされない
第2の事例は、インプット画分（Input）にはプレイタンパク質が存在するものの、免疫沈降を実施してもプルダウンされず、免疫沈降画分（IP:GFP）にプレイタンパク質が検出されない事例です。イラストで示されるように、免疫沈降画分にプレイタンパク質が認められない一方、GFPタンパク質とGFP-ベイトタンパク質は問題無くプルダウンされていることを確認できます。すなわち、この結果はプレイタンパク質に問題があることを示しています。
このような事例は、プレイタンパク質が適切にフォールディングされず、変性して不溶化することで、GFP-ベイトタンパク質との適切な相互作用が失われている場合に多く見受けられます。また、免疫沈降後の洗浄条件が極端に厳しいことでプレイタンパク質が流出している可能性も考えられます。
こうした場合は、タンパク質の発現条件や、細胞溶解、免疫沈降、洗浄時のバッファー組成や操作条件を変えて予備実験を行うことで、プレイタンパク質の免疫沈降時の実験条件を最適化する必要があります。また、仮説とは異なりベイトタンパク質とプレイタンパク質の相互作用が実際には生じていない可能性や、選択したベイトタンパク質に融合させたタグタンパク質がプレイタンパク質との相互作用に干渉している可能性についても検討が必要です。
III：プレイタンパク質が非特異的にプルダウンされる
第3の事例は、GFPタンパク質を使用して免疫沈降を実施した場合や、GFP-ベイトタンパク質が存在しない条件で免疫沈降を実施したにもかかわらず、免疫沈降画分（IP:GFP）にプレイタンパク質が認められる事例です。この場合、プレイタンパク質がGFP-Trap®によって非特異的にプルダウンされていると考えられます。
第2の事例と同様に、プレイタンパク質が適切にフォールディングされないまたは変性することによって、プレイタンパク質がVHH抗体（別名：Nanobody®）やビーズ担体、使用したプラスチック器具等と非特異的に相互作用してしまっている可能性があります。
トラブルシューティングの際は、プレイタンパク質が適切にプルダウンされる最適条件を見つける必要があります。多くの場合、より厳しい洗浄条件の適用や低吸着性のプラスチック器具を採用することで、プレイタンパク質の非特異的な結合を防ぐことができます。さらに、プレイタンパク質の発現条件、細胞溶解や免疫沈降のバッファー組成や操作条件を変えた予備実験の実施を推奨します。予備実験はベイトタンパク質の存在しない条件で実施し、プレイタンパク質が非特異的にプルダウンされない条件を決定後、GFP-ベイトタンパク質の存在下で共免疫沈降を再度実施してください。
トラブルシューティングではコントロール実験の設計が重要となります
コントロール実験は共免疫沈降で良好な結果を得るために重要であるだけでなく、トラブルシューティングを実施するためにも重要な役割を担います。トラブルシューティングを実施する際は、ポジティブコントロールとネガティブコントロールの実験結果をそれぞれ確認しなければ、問題点を特定することができず、共免疫沈降の実験結果を適切に解釈することができません。特に共免疫沈降実験では、偽陰性や偽陽性の結果を誤って解釈してしまわないためにも、コントロール実験の設定・設計が重要となり、多くの場合、実験を最適化するための予備実験を行う必要があります。
（※ 国内におけるプロテインテック製品の出荷および販売は、コスモ・バイオ株式会社を通じて行っております。
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免疫沈降および共免疫沈降のトラブルシューティングについては、プロテインテックのウェビナー「immunoprecipitation (IP) troubleshooting online training」もご覧ください。
共免疫沈降実験の詳細については、ブログ「共免疫沈降（Co-IP）の実施方法」をご覧ください。
