ヒントとコツ | 免疫組織化学のためのマウスオンマウス
マウス組織にマウス由来抗体を使用するIHC実験は、オフターゲット染色の可能性が生じるため、困難な実験となる場合があります。そうした問題を軽減し、信頼性のある結果を得るためのマウスオンマウス染色の実施方法を学びます。
マウスモデルは、基礎生理学の解明から創薬の促進に至るまで、ライフサイエンス研究において幅広く使用されています。免疫組織化学（IHC）は、マウス組織でよく使用される手法であり、特定タンパク質の関与や、実験条件に対してどのような反応を示すかを可視化します。この手法の欠点の1つは、多くの抗体（特にモノクローナル抗体）がマウスで産生されることです。これにより、マウス組織で「抗マウス」二次抗体を使用すると、組織内在性マウスIgGやFc受容体に結合する可能性があり、高いバックグラウンドや非特異的染色の原因となります。そのため、多くの研究者は当然のことながら、マウス組織へのマウス一次抗体の使用に慎重であり、概してそのような実験を回避する傾向にあります。しかし、マウスオンマウス（MOM）を回避する必要はなく、この記事で取り上げる染色のヒントがあれば、使用したいと考えている抗体をマウス組織でも引き続き使用できます。
Tip 1：実際に試して確認する―コントロール実験―
どの時点においてMOM染色が高いバックグラウンドや非特異的シグナルを生じさせるかの予測は困難です。そのため、この段階での最善策は、実際に適切なコントロールを設定してバックグラウンド染色の程度を明らかにし、実験結果の信頼性を評価することです。計画通りにIHCを実施してみましょう。その際に可能であれば、一次抗体を使用しないで二次抗体のみを使用するコントロール実験と、一次抗体の代わりにアイソタイプコントロール抗体*を使用するコントロール実験も設定してください。こうしたコントロール実験を実施すると、観察されたシグナルが、オフターゲットに二次抗体が結合することで生じたシグナルではなく、一次抗体と二次抗体の特異的結合に由来するシグナルであることを確認することができます。コントロール実験でバックグラウンドが確認されない場合は、実験結果に問題はありません。後で問題が発生した場合に備えて、すべての実験でこれらのコントロールを含めて実施してください。プロテインテックでは抗体保証サービスを提供しております。ご安心して、プロテインテックのマウスモノクローナル抗体をお試しください。もし、マウス組織で高いバックグラウンドが確認され、ご満足いただけない場合は交換を含めた対応を利用可能です。
*アイソタイプコントロール抗体を使用する場合は、一次抗体と同じサブクラス抗体（マウスには4つのIgGサブクラスがあります）を同じ濃度で使用してください。一次抗体と同一メーカーの製品の使用を推奨します。（こちらからプロテインテックのマウスモノクローナル抗体アイソタイプコントロールをご覧いただけます）。
Tip 2：内在性マウスIgGのブロッキング
多くの場合、内在性IgGは組織内の残留血液が原因となり存在しています。したがって、MOM染色で高いバックグラウンドが認められた場合、第一の対処法として摘出組織を氷冷したPBSで灌流してから、4％パラホルムアルデヒドで潅流または浸漬固定してください。
灌流が不可能な実験の場合、または、灌流を実施しても高いバックグラウンドが見られる場合、次の対処法として、内在性マウスIgGのブロッキングをお試しください。一次抗体や二次抗体で染色する前に、推奨濃度0.1 mg/mlの抗マウスF（ab）フラグメント抗体とインキュベーションします。これは、二次抗体宿主由来の血清（例：ヤギ正常血清）や0.5% Triton-X含有BSA等とインキュベーションする通常のブロッキング操作の後に実施してください。この追加のブロッキング操作を実施してから、通常通り抗体染色を実施してください。
補足：FFPE（ホルマリン固定パラフィン包埋）試料のFc受容体は、通常はIHCプロトコールの固定、脱水、パラフィン除去の各操作で非活性化されるため問題になりません。ただし、Fc受容体が高いバックグラウンドの原因である可能性が考えられる場合は、この記事のTip 2〜4を実施してこの現象を防止してください。
Tip 3：抗体複合体を形成させる
Tip 2の操作の代わりに、一次抗体－二次抗体複合体を形成させてから組織とのインキュベーションを実施することでMOM染色の問題を改善することができます。この方法についてGoodpaster and Randolph-Habecker (2014)らが成功例を発表していますが、論文ではマウス一次抗体と、二次抗体として抗マウスF（ab）抗体を1：2の比率（二次抗体2µgあたり一次抗体1µg）で20分間インキュベーションしてから、マウス正常血清と二次抗体の比率を10：1にして10分間インキュベーションを実施することを推奨しています。この操作で複合体をスライド試料に結合させ、続いてストレプトアビジン-HRPで検出します。この方法だと、組織に添加する前に二次抗体は一次抗体に結合し、一次抗体に結合しなかった二次抗体はマウス血清に結合するため、二次抗体がオフターゲットへ結合することがありません。これは図1にわかりやすく示されています。ビオチンを使用しない検出方法やその他の方法の詳細についてはこちらの論文をご覧ください。
図1. 腎臓（A、B、C）、脾臓（D、E、F）、腸（G、 H、I）組織。抗マウス二次抗体のみで染色した場合（A、D、G）は、生物学的シグナルと間違えられる可能性のある多くの非特異的染色が観察されます。一次抗体を最初にF（ab）二次抗体と複合体化すると、アイソタイプコントロール抗体を使用しても染色されず（B、E、H）、抗SMAマウス抗体を使用すると特異的に染色されます（C、F、I）。SMA =平滑筋アクチン（smooth muscle actin）。図はGoodpaster and Randolph-Habecker (2014)（オープンソース）から転載しました。
Tip 4：直接標識抗体を使用する
MOM染色の問題の大部分は二次抗体に起因し、直接蛍光標識された一次抗体を採用して二次抗体を使用しないことで、こうした問題を排除することが可能となります。現在、多くの抗体メーカーは、検出酵素または蛍光色素を直接標識した一次抗体を製造しています。これには、IHCプロトコールの合理化、バックグラウンドの低減、解像度の向上、MOMにおける二次抗体の問題の排除等の複数の利点があります。プロテインテックでは、よく利用されるマウスモノクローナル抗体の多くに、IHCや免疫蛍光染色で多岐に及ぶ検証を実施したCoraLite®蛍光色素を直接標識しています。主に3色のCoralite®488、 Coralite®594 、 Coralite®647をご利用いただけます（図2）。プロテインテックの製品やCoraLite®直接標識抗体はこちらをご覧ください。
図2. 精巣タンパク質BOULE（A、B、C）、DAZL（D、E、F）、TNP1（G、H、I）に対してCoraLite®直接標識抗体を一次抗体として実施した免疫染色の結果。CoraLite® 488（A、D、G）、CoraLite® 594（B、E）、CoraLite® 555（H）、CoraLite® 647（C、F、I）を使用。本実験はマウスの精巣組織で実施されています。
最後に
IHC実験は、順調に実験が進んでいる時であっても注意が必要な場合があり、マウスオンマウス染色は特に困難な実験です。高価な市販のキットを使用せずにこうした問題を軽減して論文化に値する結果を出す方法が多数あることを、ここまでご紹介しました。良い実験結果が得られることをお祈りします！
