Haloタグ（HaloTag®）とは？
Haloタグ（HaloTag®）は、タンパク質タグの1つであり、外因的に添加される合成リガンド（基質）と共有結合を触媒する「自己標識化タンパク質タグ（self-labeling protein tag）」として知られます。Haloタグは、研究対象とする目的タンパク質（POI：protein of interest）と融合させることで、融合タンパク質の細胞内解析や生化学的解析に利用できます。また、Haloタグはライブセル（生細胞）イメージングに使用することも可能です。
- Haloタグとは？
- Haloタグの作用機序とは？
- Haloタグとリガンドの複合体はどのように形成されるのか？
- Haloタグのサイズとは？
- Haloタグを使用できるアプリケーションとは？
- どのようなリガンドが使用できるのか？
- 市販されているHaloタグには複数の種類があるのか？
- HaloタグとSNAPタグの違いとは？
- HaloタグとGFPタグの違いとは？
- ウェスタンブロットでHaloタグを検出する方法
- Haloタグ融合タンパク質の免疫沈降
- 既に基質（リガンド）が結合しているHaloタグのプルダウンアッセイは可能か？
- Haloタグの溶出法
- Haloタグの結合カイネティクスとは？
- Haloタグの励起／蛍光波長について
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Haloタグとは？
Haloタグとは、Rhodococcus rhodochrous（ロドコッカス・ロドクラウス）のハロアルカンデハロゲナーゼ（haloalkane dehalogenase）をコードするDhaA遺伝子に由来する「自己標識化タンパク質タグ（self-labeling protein tag）」です。Haloタグは、タンパク質タグの1つであり、目的タンパク質（POI）を標識するために使用されます。
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Haloタグの作用機序とは？
Haloタグ融合タンパク質をコードするプラスミドをトランスフェクション（遺伝子導入）することによって、細胞または動物中でHaloタグ融合タンパク質を発現させることができます。発現させたHaloタグ融合タンパク質は、以下に示すようなHaloタグに特異的なリガンドとインキュベーションすることで、蛍光検出等のアプリケーションに利用可能な標識体となります（6.参照）。
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- HaloTag蛍光色素リガンド：Haloタグ融合タンパク質が蛍光標識され、蛍光検出が可能になります。
- HaloTagビオチンリガンド：Haloタグ融合タンパク質がビオチン標識され、ストレプトアビジン固相化担体への固定化やその他の標識ストレプトアビジンによる修飾を実施することができます。
Haloタグは、一度リガンドと複合体を形成すると、触媒中心が塞がれるため、それ以降にその他のリガンドは結合することができなくなります。リガンド結合後のHaloタグ融合タンパク質の検出や免疫沈降（IP）を実施する場合は、リガンドの代わりとして、塞がれた触媒中心の外部領域に結合する抗体やVHH抗体（別名：Nanobody®）を使用します（10.、11.、12.参照）。
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Haloタグとリガンドの複合体はどのように形成されるのか？
上述したように、HaloタグはハロアルカンデハロゲナーゼであるDhaAに由来するタンパク質タグです。Haloタグの活性部位は遺伝子改変されており、クロロアルカン（chloroalkane）を有する基質が不可逆的に活性部位と結合します。ビオチン、Alexa Fluor® 488、TMR（Tetramethylrhodamine、テトラメチルローダミン）等で標識したクロロアルカンリンカーがHaloタグのリガンドとして市販されており、利用することができます。
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Haloタグのサイズとは？
Haloタグは297アミノ酸残基からなり、分子量は33kDaです。
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Haloタグを使用できるアプリケーションとは？
一般的に、Haloタグは以下のアプリケーションに使用されます。
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- 免疫蛍光染色（IF）等の細胞系イメージングアッセイ
- 免疫沈降（IP）
- タンパク質精製
顕微鏡観察用に、細胞透過性の蛍光色素（TMR（テトラメチルローダミン）やクマリン等）や非細胞透過性の蛍光色素（Alexa Fluor® 488等）等で標識されたリガンドを使用できます。さらに、ビオチンやPEG‐ビオチン等の標識リガンドを使用できます。
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市販されているHaloタグには複数の種類があるのか？
現在、入手可能で市販されているHaloタグは「HaloTag 7」です。しかし、過去には「HaloTag 2」が販売されていました。HaloTag 2とHaloTag 7は、約17アミノ酸残基に違いがあり、それらはタンパク質表面に部分的に存在しています。
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HaloタグとSNAPタグの違いとは？
SNAPタグも、外因性リガンドを利用する自己標識化タンパク質タグの1つであり、蛍光標識リガンドを結合させることで目的タンパク質を蛍光標識することができます。HaloタグがRhodococcus rhodochrous（ロドコッカス・ロドクラウス）のハロアルカンデハロゲナーゼ（haloalkane dehalogenase）に由来するのとは異なり、SNAPタグはヒトのO6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase（hAGT、O6-アルキルグアニンDNAアルキルトランスフェラーゼ）に由来します。SNAPタグは非常に高い特異性で、O6‐ベンジルグアニン（O6-benzylguanine、BG）誘導体と反応し共有結合を形成します。
Erdmannら（2019）は、シリコンローダミン誘導体（SiR（Si-rhodamine）系色素）を使用したライブセルイメージングにおいて、HaloタグとSNAPタグを定量的に比較しました。著者らは、「共焦点顕微鏡およびSTED顕微鏡でSiR系色素の単色イメージングをする場合は、Haloタグを使用した方が蛍光が強く、急速に退色しないことから、第一の選択肢としてHaloタグ融合をまず実施することを推奨する（"For single-color imaging of SiR-based dyes, by either confocal or STED microscopy, we recommend Halo tagging as a first choice, since it provides fluorescence that is brighter and less prone to bleaching rapidly"）」と結論付けています。
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特性 |
Haloタグ |
SNAPタグ |
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発見／最初の論文投稿 |
2008 |
2008 |
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由来 |
Rhodococcus rhodochrous 由来 |
human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase |
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構造 |
単量体 |
単量体 |
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反応基質 |
Chloroalkane（クロロアルカン）誘導体 |
O6-benzylguanine（O6‐ベンジルグアニン、BG）誘導体 |
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リガンド |
色素、蛍光色素、ビオチン（細胞透過性／細胞非透過性の両方で使用可）、免疫沈降用ビーズ標識リガンド |
色素、蛍光色素、ビオチン（細胞透過性／細胞非透過性の両方で使用可）、免疫沈降用ビーズ標識リガンド |
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励起波長／最大蛍光波長 |
標識蛍光色素の特性に依存 |
標識蛍光色素の特性に依存 |
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鎖長／分子量 |
アミノ酸残基数：297残基 |
アミノ酸残基数：182残基 |
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HaloタグとGFPタグの違いとは？
GFP（Green Fluorescent Protein、緑色蛍光タンパク質）は、内因性の蛍光タンパク質です。励起波長を照射すると、タンパク質自体が蛍光を発します（厳密に述べると、GFPはβバレル構造を有しており、GFPが発する蛍光はβバレル構造の中心に位置する3つのアミノ酸残基の環化および酸化によって生じます。この化学反応によって、2つの環状構造を有する発色団が形成されて蛍光が発生するのです）。GFPタグを使用する場合、別途、基質やリガンドを用意する必要はありません。化学発光色素と比較した場合、一般的にGFPタンパク質の耐光性や量子収率は劣ります。
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ウェスタンブロットでHaloタグを検出する方法
ChromoTek（クロモテック：2020年よりプロテインテックの一部）の、検証済みかつ高感度なanti-Halo mouse monoclonal antibody（カタログ番号：28A8）を使用してウェスタンブロットを実施できます。
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Haloタグ融合タンパク質の免疫沈降
プロテインテックでは効率的な免疫沈降を実現するHalo-Trap Agarose（カタログ番号：ota）およびHalo-Trap Magnetic Agarose（カタログ番号：otma）を販売しています。Halo-Trapは免疫沈降用のアガロースビーズまたは磁性アガロースビーズに結合した抗HaloタグVHH抗体（別名：Nanobody®）からなる製品であり、免疫沈降におけるVHH抗体の長所とHaloタグの汎用性を兼ね備えています（参考：Proteintech HP ChromoTek VHH試薬）。
Halo-Trapを無償で提供しています。下記フォームよりご依頼ください。
（※ 国内におけるプロテインテック製品の出荷および販売は、コスモ・バイオ株式会社を通じて行っております。
最寄りのコスモ・バイオ株式会社 代理店をご指定の上、ご依頼ください。）
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既にリガンドが結合しているHaloタグ融合タンパク質のプルダウンアッセイは可能か？
既にHaloタグ融合タンパク質がリガンドに結合している状態であっても、プルダウンアッセイは可能です。クロモテックのHalo-Trapは、触媒中心と重複しない領域のエピトープに結合します。したがって、Halo-Trapを使用して、既に基質（リガンド）が結合しているHaloタグ融合タンパク質の免疫沈降やプルダウンアッセイを実施することができます。
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Haloタグ融合タンパク質の溶出法
Halo-Trapによる免疫沈降を実施後、100mMクエン酸（pH3）、または200mMグリシン（pH2.5）を使用してビーズに結合したHaloタグ融合タンパク質を溶出することができます。
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Halo-Trapの結合カイネティクスとは？
Haloタグに使用されているVHH抗体の結合カイネティクス（速度論）については、詳細な特性解析が実施されています。ターゲットと迅速に結合し、解離する速度が遅いことから、解離定数（KD）はわずか1nMと親和性が極めて高く、発現量の少ないタンパク質の効率的なプルダウンを実現します。
結合速度
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解離定数 |
結合速度定数 |
解離速度定数 |
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Halo-Trap |
2.30 x 10-9 |
5.40 x 105 |
1.24 x 10-3 |
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Haloタグの励起／蛍光波長について
Haloタグタンパク質自体は、可視スペクトルや赤外スペクトル領域に内因性の励起／蛍光波長を有しません。蛍光検出する場合は蛍光標識された外因性リガンドを使用するため、励起波長および蛍光波長は標識された蛍光色素に依存します。例えば、Alexa Fluor® 488の場合、最大励起波長は490nmで最大蛍光波長は525nmです。
参考文献
