ブログ
ビギナーズガイド | 免疫組織化学（IHC）染色

ビギナーズガイド | 免疫組織化学（IHC）染色

免疫組織化学（IHC）染色をこれから始める方のための12の最適化検討ポイントについて解説します。

Sarah Etheridge著、改訂：Swati Roy（プロテインテック、Product Manager）

免疫組織化学染色（IHC：Immunohistochemistry）は、微細構造を保持した完全かつそのままの状態、すなわち生きている時と同じ「現実（Real life）」の状態にある組織内のタンパク質を可視化できる手法です。「現実」を可視化する利点の1つは、正常組織と病変組織を比較できることであり、免疫組織化学染色は研究者および病理医にとって極めて有益な手法となります。免疫組織化学染色のプロトコールは複雑ではありませんが、標的タンパク質とそのタンパク質に特異的な抗体が確実に結合し、最適な染色像を得るためには、はじめに最適化しておくべき複数のステップが存在します。本稿では、免疫組織化学染色の各ステップについて、いくつかの重要なポイントと微調整が必要となる実験条件について解説します。

1. 組織サンプルの調製

免疫組織化学染色では、凍結または固定した組織サンプルを使用します。一般的に組織ブロックや組織切片を凍結させた場合、標的抗原の立体構造が維持されるため、抗体が良好に結合できますが、組織内に小さな氷晶が形成される可能性があり［1,2］、長期的保存には適さない傾向があります。一方、組織の固定およびパラフィン包埋処理を施した場合、組織切片スライドをある程度の長期間保存することができます。組織の固定・包埋法の中で最も一般的手法は「ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE：formaldehyde fixation with paraffin embedding）」と呼ばれる方法です。FFPE処理を施した組織は室温でいつまでも保存できるため、医学研究において過去の事例や症例を参照できる重要なリソースとなります。組織を固定する場合、氷冷したメタノール：アセトン（50:50）（MeAc固定液）または4% パラホルムアルデヒド（4% PFA）溶液で固定すると抗体のエピトープ（抗体結合部位）への結合を改善できる場合もあります。例えば、MeAc固定液は細胞質タンパク質を溶解させるため、膜結合タンパク質のより良好な染色に有効です。

2. 抗原賦活化

ホルムアルデヒド固定は、組織内のタンパク質を架橋させて組織の形態を維持することができる一方［3］、エピトープの変性を引き起こすおそれがあります。そのため、通常はFFPE切片を染色する前に抗原賦活化を実施し、覆われた（または変性した）標的エピトープを再び露出させる必要があります。抗原賦活化は「加熱処理」または「酵素処理」によって実施され［1,4］、温度、pH、処理時間等の要因がその結果に影響します。初めて使用する抗体と組織の組み合わせで染色を行う場合には、抗原賦活化法を一通り試して、特異的なシグナルを増強し非特異的なバックグラウンドを抑制する最適な条件を決定することをおすすめします［5］。まずは、クエン酸ナトリウムバッファー（pH6.0）に検体を浸漬し、電子レンジを使用して加熱する方法を試すと良いでしょう。なおFFPE切片は、抗原賦活化と染色を行う前にキシレンとアルコール（エタノール）で脱パラフィン処理を施す必要があります。すなわち、切片をキシレンに浸漬して脱パラフィン処理した後、段階的にエタノール濃度を下げた溶液に順に浸漬することで切片を再水和します。凍結切片の場合、抗原賦活化は不要ですが、染色する前に切片を少なくとも１時間は風乾する必要があります。

熱処理法（HIER：Heat-Induced Epitope Retrieval） Tris-EDTAバッファー（pH 9.0）処理	タンパク質分解酵素処理法（PIER：Proteolytic Induced Epitope Retrieval） Protease Kバッファー処理

異なる抗原賦活化法により実施された免疫組織化学染色の比較画像。サンプル：VWFポリクローナル抗体（カタログ番号：27186-1-AP）を使用してヒト扁桃炎組織を染色しました。左：Tris-EDTA抗原賦活化バッファー（pH 9.0）（カタログ番号：PR30002）を使用して加熱抗原賦活化処理（HEIR）を実施。右：Protease K抗原賦活化バッファー（カタログ番号：PR30014）を使用してプロテアーゼによる抗原賦活化処理（PIER）を実施。

表1. プロテインテックの抗原賦活化バッファー

製品名	カタログ番号
クエン酸ナトリウム抗原賦活化バッファー（pH 6.0）	PR30001
Tris-EDTA抗原賦活化バッファー（pH 9.0）	PR30002
Protease K抗原賦活化バッファー	PR30014

3. 組織サンプルの取り扱い

脱パラフィン・再水和後の組織切片は乾燥しないように取り扱うことが重要となります。そのため、切片をインキュベーションする間は乾燥を防ぐためにIHC染色専用のトレイ（湿潤箱）を使用します。様々なメーカーが切片の湿度を維持できる染色用のトレイを販売しています。専用のトレイがない場合は、組織の水浸に用いるトレイを使用します。

重要なポイント：A-PAP Penのような撥水性ペンを使用してみましょう。PAPペンはサンプルの周囲にサークルを描くと、薄いフィルム状の囲いを作ることができるマーキングペンであり、切片周辺に溶液を保持します。PAPペンの使用は必須ではありませんがあると便利です。なお透過処理やMeAc固定処理を行う前に撥水性ペンを使用しないでください。Tritonのような界面活性剤またはMeAcのような有機溶媒によって撥水性インクが溶解し、組織に付着する場合があります。

プロテインテックの関連製品：撥水性ペン（Hydrophobic IHC pen）

4. 透過処理

様々なタンパク質に対してIHC染色を実施するほとんどの場合、プロトコールに透過処理のステップを追加することを推奨します。エピトープが細胞外領域に存在する膜貫通タンパク質を染色する際は、透過処理を実施しなくても良い場合もあります。透過処理として、例えば界面活性剤（例：0.1% Triton X-100を含むPBS溶液）中でインキュベーションする方法があります。界面活性剤は、主な働きである膜透過性の促進だけではなく、ホルムアルデヒド固定の際に形成される細胞外マトリックスタンパク質の架橋を破壊することで抗体のエピトープへのアクセスと結合を促し［1］、非特異的な疎水性相互作用を低減します。

重要なポイント：（特にFFPE切片を染色する場合）うまく染色できない場合は、すべての溶液にTriton等の界面活性剤を低濃度になるよう添加してみてください。

5. ブロッキング

ブロッキング剤は組織内の非特異的部位にあらかじめ結合し［1］、一次抗体／二次抗体が組織成分に非特異的に結合することを防ぐ役割を担います。例えば、ウシ血清アルブミン（BSA）や二次抗体の産生動物（免疫動物）由来の血清等の「反応に影響しないタンパク質溶液」で組織切片をインキュベーションします。まずは3% BSA溶液で20～30分間インキュベーションする方法を試すのが良いでしょう。プロテインテックでは、通常3% BSA溶液を使用してブロッキング処理を行っていますが、代替として5～10%の動物血清も使用しています。免疫動物がヤギの二次抗体を使用する場合、ブロッキングにヤギ血清を選択します。

6. 一次抗体の選択

一次抗体を選ぶ際は、目的タンパク質の発現レベルのほか、共局在の解析を実施する際に使用する抗体を考慮して検討する必要があります。つまり、多重染色を実施する場合、一次抗体には異なる免疫動物種由来の抗体を使用して、各二次抗体が各一次抗体に特異的に結合し、両者を区別できるようにしなければなりません。また、IHC実験にモノクローナル抗体とポリクローナル抗体のどちらが適しているかについても考慮します。モノクローナル抗体を使用すると極めて特異性の高いシグナルが得られます。一方、目的タンパク質の発現レベルが低い場合は、ポリクローナル抗体を使用するとより高感度なシグナルを得られます。

プロテインテックの関連ブログ：ポリクローナル抗体VSモノクローナル抗体

表2. プロテインテックのIHC用一次抗体

一次抗体（非標識）

ビオチン標識抗体

7. コントロール実験（抗体の特異性検証）

IHCでは、一次抗体の作製に使用した免疫動物の血清に含まれる他の抗体による交差反応や非特異的結合が生じることで、目的タンパク質以外の分子が染色されてしまう場合があります。タンパク質A/G精製、アフィニティ―精製、事前吸着処理等の抗体精製技術を用いて事前に精製された抗体を使用することで、このような非特異的染色を最小限に抑えることができます。プロテインテックのすべての抗体製品は、製造時に標的抗原（組換えタンパク質／抗原ペプチド）を用いたアフィニティ精製が実施されています。別途コントロールサンプル等を使用して抗体の結合特異性を確認したい場合は、以下に示すコントロール実験を実施してください。

理想的なコントロールとなるサンプルは、目的のタンパク質を含有しない組織や細胞です。例えば、ノックアウトマウスの組織、siRNA等でターゲットタンパク質をノックダウンした細胞等が挙げられます。
抗体が正しい分子量のタンパク質を検出できているか確認するには、ウェスタンブロット（WB：Western blot）を行います。ウェスタンブロットで複数のバンドが認められた場合は、抗体が非特異的に複数のタンパク質に交差反応を示している可能性が示唆されます。
一次抗体と抗原ペプチドをプレインキュベーションして実施される吸収試験によって抗体の特異性を確認することができます。アフィニティ精製済の抗体を使用する場合は、精製時に抗体がターゲットとする特異的なペプチド配列・組換えタンパク質・免疫原分子を使用しているため、この吸収試験を実施する必要はありません［6］。
カスタム作製した抗体を使用する場合は、抗体作製過程の様々な段階で採取された血清を使用してウェスタンブロットを実施し、目的のタンパク質の分子量付近のバンドが正しい画分に検出されるかどうかを確認してください。

プロテインテックの関連アプリケーション：ウェスタンブロット

一次抗体を添加するステップを省略し、抗体希釈用の溶液のみをサンプルに添加してインキュベーションを実施するといった、一次抗体のネガティブコントロール実験の設定も推奨されます。このネガティブコントロール実験を並行して実施することで、観察された染色が一次抗体とターゲットの結合により生じたものであり、二次抗体や検出試薬の非特異的な相互作用による染色ではないことを確認します。

もう1つの重要なコントロールは、目的タンパク質の陽性染色が得られる組織スライドを用いるポジティブコントロール実験です。このコントロール実験を含めれば、対象組織が染色されない場合に、実際に適用したIHCの染色手順で問題無く目的タンパク質を染色できているかどうかを確認することができます。

8. 抗体の希釈倍率

通常、市販されている抗体の推奨希釈倍率はデータシートや製品ページに記載されています。記載がない場合は最適化のために希釈倍率1:50～1:300の範囲で抗体原液を希釈してIHC染色を実施することを推奨します。新しく購入した抗体を使用する際は、様々な希釈倍率の一次抗体を調製して予備検討を実施すると良いでしょう。一次抗体をブロッキング溶液（例：3% BSA含有PBS溶液）で希釈し、室温で1～2時間、または4℃で一晩インキュベーションします。

希釈倍率の異なるCD68マウスモノクローナル抗体を使用したヒト扁桃炎組織の免疫組織化学染色

CD68マウスモノクローナル抗体（カタログ番号：66231-2-Ig）の希釈倍率を段階的に変更して実施したヒト扁桃炎組織の免疫組織化学染色。この場合の最適な希釈倍率は1:3200～1:6400の範囲です。

9. 洗浄

洗浄時はPBS等を洗浄溶液として使用し一次抗体を除去します。洗浄操作は素早く実施します。5分×3回洗浄すれば十分です。凍結切片は非常に壊れやすいため、溶液を滴下する際は切片の近くにゆっくり滴下してください（例：1 mLピペット等を使用します）。

重要なポイント：洗浄用バッファーはPBSよりもTBS（Tris-buffered Saline）に変更すると良いでしょう。

10. 検出

一次抗体の検出には蛍光色素（例：FITC）や発色による検出が可能な酵素（例：HRP、horse-radish peroxidase）が標識された、一次抗体の免疫動物の免疫グロブリンを認識する二次抗体を使用して行います。以下に目的タンパク質を検出するためのポイントを紹介します。

バックグラウンド染色は実験間でばらつきがあるため、一次抗体を省略して二次抗体のみを添加するネガティブコントロール実験を都度実施することを推奨します。バックグラウンド染色は、マウス由来の一次抗体をマウス組織の染色に使用する際にも問題となります（マウスオンマウス／MOM）。バックグラウンド染色を低減するには、一次抗体の濃度を下げる、または二次抗体とのインキュベーション時間を短縮するといった措置を試してみます。
二次抗体をブロッキング溶液で希釈します。通常は、希釈倍率が1:800～1:1000程度になるよう希釈して使用します。最適な染色像が得られるように希釈倍率を適宜調整してください。

蛍光IHCの場合

使用する顕微鏡が使用予定の蛍光色素に適合していることを確認してください。蛍光を観察する際は、二次抗体に標識された蛍光色素間のスペクトルの重複、二次抗体間の交差反応、イメージング時の蛍光の漏れ込み等がないよう留意します。
蛍光標識抗体を添加した後は、退色を防ぐために切片を暗所におきます。
インキュベーション後は、切片をPBSで数回洗浄してから封入剤を添加し、カバーガラスを上から慎重に被せてください。
気泡が入らないように静かにカバーガラスを下ろします。凍結切片の場合は特に注意が必要です。カバーガラスを被せる際は、切片を強く擦りつけたり圧迫しないようにしてください。切片の組織が破壊される場合があります。
蛍光色素が直接標識された一次抗体を使用して蛍光検出を実施することも可能です。蛍光標識済み一次抗体を使用すると、実験に要する時間を短縮でき、二次抗体由来の擬陽性シグナルを低減することができますが、相対的なシグナル強度は低下する場合があります。
シグナル強度を増幅させたい場合は、アビジン-ビオチン複合体（ABC：Avidin-biotin-complex）法や酵素標識ストレプトアビジン（LASB：Labelled streptavidin–biotin）法、ポリマー法（高分子ポリマー法）等を検討してください。

インスリンマウスモノクローナル抗体およびIHC発色キットを使用したマウス膵臓組織の免疫組織化学染色

インスリンマウスモノクローナル抗体（カタログ番号：66198-1-lg）およびマウス一次抗体用IHC発色キット（カタログ番号：PK10010）を使用したマウス膵臓組織の免疫組織化学染色。

表3. プロテインテックのIHC発色キット（HRP-ポリマー染色検出キット）

製品名	検出対象	カタログ番号
IHC Detect Kit for Mouse Primary Antibody	マウスIgG	PK10010
IHC Detect Kit for Rabbit Primary Antibody	ウサギIgG	PK10009
IHC Detect Kit for Rabbit/Mouse Primary Antibody	ウサギIgG／マウスIgG	PK10006

11. 対比染色

組織検体スライドの一次抗体での染色後に対比染色を実施すると、IHCデータのコントラストが明瞭になるとともに、複雑な組織構造内に「目印」を浮かび上がらせることができ、目的タンパク質の局在をより正確かつ詳細に観察することができます。発色による染色を検出するのか、あるいは蛍光を検出するのかによって、異なる対比染色方法を選択する必要があります。様々な対比染色剤が存在しますが、核の対比染色剤の場合、代表的な染色試薬として発色検出であればヘマトキシリン、蛍光検出であればDAPIが幅広く使用されています。

12. 初期検討時の最適化検討ポイント

IHCのプロトコールには最適化を検討すべきステップが多くありますが、心配する必要はありません。IHC実験を行う際は、以下に示したステップから最適化を始めてください。

抗原賦活化方法
一次抗体の希釈倍率
ブロッキング溶液の種類

ラボで最適な条件を検討する代替手段として、プロテインテックのIHC染色キット「IHCeasy」のご利用もご検討ください。IHCeasyキットは、IHC染色で高品質なデータを得られるよう、脱パラフィン・再水和後のサンプルに必要な全ての試薬と一次抗体および二次抗体がセットになった、抗体希釈倍率とプロトコールが最適化済みのコンプリートキットです。

すべてのIHCeasy キットはこちらをご覧ください。

使用したい一次抗体が既に決まっている場合は、プロテインテックの「IHC前処理&発色キット」をご検討ください。IHC前処理&発色キットは、抗原賦活化から封入までに必要な試薬がセットになったIHC用キットです。一次抗体は含まれていないため、お手持ちの一次抗体と組み合わせて使用できます。

表4. プロテインテックのIHC前処理&発色（Prep & Detect）キット

製品名	検出対象	カタログ番号
IHC Prep & Detect Kit for Mouse Primary Antibody	マウスIgG	PK10018
IHC Prep & Detect Kit for Rabbit Primary Antibody	ウサギIgG	PK10017
IHC Prep & Detect Kit for Rabbit/Mouse Primary Antibody	ウサギIgG／マウスIgG	PK10019


NRAS IHCeasyキット（カタログ番号：KHC0279）を使用したヒト悪性黒色腫組織の免疫組織化学染色。	サイトケラチン19マウスモノクローナル抗体（カタログ番号：60187-1-lg）およびマウス一次抗体用IHC 前処理&発色キット（カタログ番号：PK10018）を使用したヒト結腸組織の免疫組織化学染色。